烟叶碱虽然是四种主要烟草生物碱之一，但在烟叶属的任何自然存在的物种中都不会积累大量的烟叶碱。因此，以往的研究主要集中在利用转基因方法合成阿那他滨，特别是通过产生具有抑制腐胺甲基转移酶(PMT)活性的转基因品系。这导致了令人鼓舞的结果，但具有如此独特代谢的植物的全局基因表达尚未得到分析。在当前的研究中，我们描述了这些植物如何响应顶和下游影响生物碱的生物合成。
分析了打顶后PMT转基因品系阿那他滨积累量激增及其对基因表达变化的影响。结果显示异黄酮样还原酶(A622)和小檗碱桥样酶(BBLs)氧化还原酶基因的表达增加，这些基因在尼古丁生物合成的最后步骤中起着至关重要的作用。我们还观察到，在所有接受打顶处理的植株中，甲基腐胺氧化酶(MPO)的表达均显著升高。为了研究MPO抑制是否与PMT具有相同的效果，我们制作了转基因植株。MPO表达受到抑制的植株叶片尼古丁含量几乎完全下降，而叶片阿那他滨增加了约1.6倍。
我们的研究结果是第一个具体的证据，表明抑制MPO导致烟草根中的尼古丁减少，有利于阿那他滨，并且这种阿那他滨成功地转运到烟草叶片。生物碱在植物中的转运还有待进一步研究，因为其转运效率在不同烟草种类和品种之间存在很大差异。我们的研究为更好地了解吡咯烷环的生物合成及其对阿那他滨基因表达和随后积累的影响迈出了重要的一步。
在烟叶属的各种物种中，烟碱、去甲烟碱、烟碱和烟碱这四种主要的次生代谢产物构成了绝大多数的生物碱库[1,2]。尼古丁是许多这类烟草的主要生物碱，包括普通烟草(N. tabacum L.)，其生物碱含量通常占总干重的2-4%。尼古丁约占生物碱含量的90%，去甲尼古丁和阿那他滨占剩余10%的大部分。尽管对烟碱生物碱途径进行了广泛的研究，但尚不清楚阿那他滨的生物合成是否完全依赖于烟碱的生物合成，还是需要专门的酶催化步骤[3]。
构成尼古丁的两个杂环来自两种氨基酸:吡啶环来自l -天冬氨酸，吡咯烷环来自鸟氨酸或精氨酸。吡啶环生物合成的早期阶段，l -天冬氨酸被天冬氨酸氧化酶(AO)氧化为α-亚氨基琥珀酸盐，随后由喹啉酸合成酶(QS)转化为喹啉酸，继而在喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)的酶作用下形成烟酸单核苷酸(NaMN)，见图1[4,5]。NaMN此时进入吡啶核苷酸循环形成烟酸，从而为尼古丁的生物合成提供了一个吡啶环。另一方面，吡咯烷环的形成是从另外两种氨基酸中的一种开始的，精氨酸或非蛋白质源性鸟氨酸。从这些氨基酸形成多胺腐胺可以遵循两种途径。鸟氨酸通过鸟氨酸脱羧酶(ODC)直接转化为腐胺，见图1[6,7]，精氨酸通过另一种三步精氨酸脱羧酶(ADC)介导的过程转化[8]。然后，腐胺甲基转移酶(PMT)将腐胺转化为n -甲基腐胺[9,10]，甲基腐胺氧化酶(MPO)将其进一步转化为n -甲基氨基丁醇[11,12]，而甲基腐胺氧化酶会自发环化形成n -甲基-Δ ' -吡啶离子，这是尼古丁生物合成的直接底物(图1)。在尼古丁生物合成的最后步骤中，两种功能不同的氧化还原酶至关重要。第一种是异黄酮还原酶样基因(即A622)，它将烟酸转化为3,6-二氢烟酸[9,13,14]。此时，有人提出3,6-二氢吡啶脱羧为1,2-二氢吡啶和2,5-二氢吡啶，首先直接与n -甲基-Δ ' -吡啶离子反应生成尼古丁[15]。然而，这一步骤需要次级氧化还原酶——小檗碱桥状酶(BBLs)——被认为负责吡啶和吡咯环的偶联[16]，尽管确切的作用机制仍有待发现。最后，尼古丁可通过CYP82E4酶促转化为去尼古丁，该蛋白属于细胞色素P450蛋白家族[17,18]。
图1
生物碱生物合成途径分解。每个生化转化步骤用箭头表示，定义的步骤附有酶的首字母缩写(框中提供了相应首字母缩写的完整酶名)。发生在质体中的亚细胞过程是根特异性的，在暗红色的空间中被包围。顶部后差异表达的酶被标记为红色，而其余的则被标记为绿色。生物碱生物合成的代谢物以黑色表示，最终的生物合成分子也以其结构式表示
在阿那他滨生物合成的情况下，与尼古丁不同，它的两个环都来自吡啶核苷酸。第一步，在A622的酶促作用下，将烟酸转化为3,6-二氢烟酸。由于尚未发现直接证据，也未发现阿那他滨特异性酶，先前的放射性标记和仿生研究指出3,6-二氢烟酸脱羧为1,2-二氢吡啶和2,5-二氢吡啶。在接下来的步骤中，研究表明3,6-二氢苯胺可以由这两种中间体形成。在生物合成的最后一步，3,6-二氢安纳他滨被氢化形成最终的化合物-安纳他滨[19,20]。根据阿那他滨的结构，其生物合成只需要一个吡啶环;一些转基因植物的研究证实了这一假设。第一次尝试利用RNA沉默的方法来抑制PMT的酶促作用来生产烟草株系[21,22,23]。事实上，消除PMT翻译导致抑制吡咯烷环合成和阿那他滨积累显著激增。这可以解释为烟酸衍生的吡啶环中间体过多，在缺乏n -甲基-Δ ' -吡咯啉离子的情况下，除了形成阿那他滨之外没有其他选择，这是唯一已知的由两个吡啶环组成的生物碱，与野生型(WT)植物相比，PMT抑制系中特异性积累。有趣的是，在缺乏尼古丁的未转化的烟草BY-2细胞中观察到阿那他滨的积累[24]。后来发现，这些细胞几乎不表达N-MPO，从而导致类似的PMT翻译缺失和抑制吡咯烷环的形成。在烟草毛状根中产生抗mpo细胞系，用阿那他滨代替尼古丁，进一步证实了这一点[24]。当真菌激发子和茉莉酸处理BY-2细胞时，进一步证实了特异性诱导的原代阿那他宾在BY-2细胞中的积累[25]。最后，在未转化的烟草植株中，阿那他滨的积累达到了较低水平。A622[14]和BBL[16]的表达是必要的，这表明生物碱合成的最后步骤与尼古丁相似。
最后，生物碱一旦在根中特异性合成[3]，就需要高效地运输到茎，并进一步运输到叶片。两种已知的转运蛋白与烟草的这一功能有关。神经质体定位的多药和有毒化合物挤出(MATE)家族转运蛋白被证明参与尼古丁和其他生物碱(包括阿那他滨)的空泡隔离[26]。尼古丁摄取渗透酶1(尼古丁摄取渗透酶1,NUP1)定位于质膜，也被证明参与将尼古丁和维生素B6输入细胞的特异性运输[27,28]。NUP1被归类为尼古丁特异性转运体，在分裂糖酵母酵母细胞中表达，用于生物碱摄取竞争试验[27]。尽管如此，虽然阿那他滨的尼古丁供应量是过量的10倍，但观察到NUP1摄取的显著抑制，这表明尽管NUP1主要是尼古丁特异性的，但它也可以在较小程度上运输其他烟草生物碱，如阿那他滨[27]。对另一种转化酵母酿酒酵母的研究提供了这种摄取的进一步证据，其中NUP1在其他中间体中有效地运输了阿那他滨[29]。综合证据表明，NUP1是根生长的重要调控因子，因此对尼古丁的整体生物合成潜力至关重要[27,29]。这两种类型的转运蛋白可能不是唯一参与烟草从根到叶运输阿那他滨的转运蛋白。需要进一步的研究来发现参与这一过程的所有潜在基因和蛋白质。
没有一种自然存在的物种会积累阿那他滨作为其主要生物碱[30]。据推测，这是由于与其他生物碱相比，它对昆虫的毒性相对较低，这使得阿那他滨与尼古丁相比，在进化上不适合作为对抗捕食者的主要毒性剂。这在野生烟草物种N. sylvestris和N. attenunata中得到了证明，在这些物种中，抑制PMT活性和较高的阿那他滨水平而不是尼古丁导致更容易受到食草动物的攻击[31,32]。提出了一种假设，由于阿那他滨不能被视为一种有效的防御昆虫的分子，它必须履行另一种功能，可能是在吡咯环生物合成不平衡的情况下降低细胞毒性的机制。这将防止烟酸的过度积累，而烟酸在烟叶中是有毒的[33]。
在本研究中，我们使用抑制PMT活性的转基因系来鉴定阿那他滨生物合成的候选基因。首次在控制条件下对这些品系进行了完整的转录组学分析，并对打顶处理进行了响应。利用打顶处理作为促进生物碱积累的有效方法，进一步提高生物合成基因的表达，有效鉴定差异表达基因。我们将我们的结果与生物碱定量一起提出，以反映代谢物的变化以及支持基因表达的差异。我们的研究结果表明，MPO基因在阿那他滨的生产中起着重要的作用。为了确认这些基因的功能及其对生物碱在叶片中合成和转运的影响，我们培育了MPO RNA干扰(RNAi)转基因植株。我们培育了几个品系，直到第二代(T1株)，根据MPO基因表达抑制的结果，从中选择了三个品系。测定了转基因植株和对照植株成熟叶片的生物碱含量。在所有三个MPO-RNAi系中观察到尼古丁含量几乎完全下降，同时阿那他滨增加了约1.6倍。目前的研究表明MPO是吡咯环形成和尼古丁生物合成所必需的关键基因。在其缺失的情况下，阿那他滨生物合成优先，然后这种生物碱有效地运输和积累在烟叶中。
对三种PMT抑制品系(PMT1、PMT2和PMT3)和TN90对照烟草品种的叶片和根组织中尼古丁、去尼古丁和阿那他滨进行定量分析，见图2。在本实验中，打顶对叶片生物碱化学没有或影响很小(图2A)。所有PMT抑制品系样品的烟碱积累平均仅占总生物碱的6.69%(134±16μg/g干重[DW])，去烟碱积累仅占3.01%(60±14μg/g DW)，而阿那他滨是主要的生物碱积累，占90.30%(1814±87μg/g DW)。TN90对照组中尼古丁含量为88.85%(3077±260μg/g DW)，去烟碱含量为6.53%(226±41μg/g DW)，阿那他滨含量仅为4.9%(169±39μg/g DW)。与对照TN90相比，在根组织中观察到更显著的差异，其中3个PMT抑制系的阿那他滨水平平均增加了30.24%，从对照的1690±139(μg/g DW)增加到PMT- rnai系的2201±187(μg/g DW)。作为参考背景，TN90品种积累了白利烟生物碱的典型比例:尼古丁的93.44%(5284±569μg/g DW)，去尼古丁的4.35%(246±22μg/g DW)，阿那他滨的2.21%(125±27μg/g DW)。PMT抑制品系叶片中阿那他滨含量变化不大，可能是由于生物碱测量是在打顶后24小时进行的，这太快了，无法允许阿那他滨从根转移到地上部。
图2
超高效液相色谱-质谱(UHPLC-MS)生物碱定量盒须图。PMT和TN90植株和处理(对照和顶部)的尼古丁、去甲尼古丁和阿那他滨的水平以μg/g表示，异常值以圆圈表示。叶片和根的值分别显示在图A和B中。显著不同的值用字母表示，并分组为a、b或ab(配对t检验，p < 0.001)。
根据方法部分中所述的精心选择的标准，将样本reads映射到参考基因组[34]。平均而言，所有叶片样本中94.56%的reads定位到参考基因组，其中98.33%的reads定位到参考基因模型。根样品的对应值分别为82.56%和88.64%。支持表1中提供了特定于示例的映射统计信息。与根样品相比，叶片样品中定位reads的百分比更高(支持表1)，这可归因于光合基因的高表达。整体作图效率高，与其他常用的基因组模型一致[34]，反映了其高质量和准确性，特别是在严格的作图条件下。
为了确定候选基因，我们在根系中进行了数字基因表达(DGE)，并进行了统计分析(详见方法部分)。为了确定候选基因，对未顶和顶转化的PMT抑制系(PMT1, PMT2, PMT3)进行了特异性比较，表1中的浅蓝色细胞表示。将PMT RNAi细胞系与未转化TN90的对照进行比较，如表1中浅黄色细胞所示。总共有2075个基因在这些比较中至少有一个存在统计学上的不同表达。在所鉴定的基因中，41.35%为归属于GO生物过程的基因，58.65%为功能未知的基因(见支持表2)。PMT1、PMT2和PMT3系与TN90对照比较，差异表达基因的数量趋势为:PMT-RNAi未顶与TN90未顶(90、511、122)，PMT-RNAi顶与TN90顶(173、133、181)，PMT-RNAi未顶与TN90顶(291、214、527)，PMT-RNAi顶与TN90未顶(724、911、279)，后两者数量最多，见表1中的黄色细胞。不同打顶处理的PMT-RNAi系与TN90对照植株的差异表达基因数量最多。同样值得注意的是，当比较未顶的植株和顶的植株时，PMT-RNAi系的差异表达基因数量(229、192、343)高于TN90对照(34)，见表1中的蓝色细胞。同样值得注意的是，PMT-RNAi系之间的平均基因表达差异小于与TN90对照的差异。这反映在PMT-RNAi系之间相互差异表达的基因数量(红、蓝细胞，平均217个基因)，远远少于PMT-RNAi系对TN90(黄细胞，平均346个基因)。其中一些变异可以解释为植物基因表达的性质，即使在没有环境和遗传变异的情况下，噪音也是普遍存在的[35]。然而，在基因表达分析的情况下，产生差异的是量级:PMT-RNAi系与TN90的比较比PMT-RNAi系之间的比较平均多产生1.59倍的基因。在比较相同基因型的PMT-RNAi系时，观察到额外的0.59X变异。部分原因是由于生物碱生物合成基因(PMT，亚精胺合成酶[SDS])，而其余部分则由具有一般或未知功能的基因组成。这些很可能与转化品系的特定代谢变化密切相关;然而，阐明它们的作用将需要更多的基因特异性研究。
表1数字基因ex两两比较实证分析总结根样品的压力(DGE)。蓝色细胞表示未顶和顶处理的PMT系(PMT1, PMT2和PMT3)与TN90之间的差异表达基因数量，而PMT系(PMT1, PMT2和PMT3)与TN90之间的差异表达基因数量在未顶和顶处理中均表示情况用黄色细胞表示。红细胞对应于PMT系之间的比较，不用于下游分析。TN90未加顶与加顶的比较结果显示为绿色细胞
在鉴定的2075个差异表达基因(见支持表2)中，35个可能与已知的生物碱生物合成代谢有关。这些基因及其染色体数目、基因长度和RPKM表达值列于表2。每个基因还用Swiss-Prot或Solyc标识符进行注释，如方法部分所述。候选基因(天冬酰胺酶[AD]、天冬氨酸氧化酶[AO]、QS、QPT、ODC、SDS、PMT、A622、BBL)涵盖了吡啶和吡咯烷环形成过程中已知的所有酶法步骤，以及尼古丁生物合成的最后步骤，如图1所示。
表2数字基因ex与实证分析统计比较确定的候选基因列表根压(DGE)。给出了PMT株系(PMT1、PMT2、PMT3)和TN90的根、叶组织以及无顶和有顶植株的基因ID、染色体数目、基因长度以及RPKM值(±标准误差)。对于每个基因，Swiss-Prot和最佳对应在支持表2中提供了番茄Solyc标识符和参考编号
在比较无顶和无顶植株根系中的基因表达时，影响尼古丁生物合成的主要差异是诱导5种PMTs (NITAB068130、NITAB068133、NITAB068134、NITAB020971和NITAB020972)的下调，与TN90相比，PMT-RNAi系中预期的抑制功能一致(见表2)。有顶植株与无顶植株中上调的基因只出现在TN90中。三个SDS基因(NITAB026467, NITAB041017和NITAB055952)，两个基因注释为ODC (NITAB012942和NITAB023946)，三个基因为胺氧化酶(可能是MPO;NITAB041830, NITAB056529，和NITAB056530，见下文)。在PMT-RNAi系和TN90中也观察到参与吡啶环形成的基因上调:两个AD基因(NITAB013732和NITAB023723)编码的酶可能是l -天冬氨酸转化为天冬氨酸的第一步，两个AO基因(NITAB045325和NITAB079852)编码天冬氨酸转化为α -亚氨基琥珀酸，两个QS基因(NITAB063722和NITAB074182)和一个QPT基因(NITAB041007)。间接影响这部分生物碱的生物合成，我们还观察到两个s -腺苷蛋氨酸合成酶基因(SAMS;NITAB004477和NITAB038231)直接提供PMT酶促反应所需的辅助因子s -腺苷蛋氨酸，以及其他甲基转移酶[36]。在顶部植物的根样品中检测到其他转录本，可能在生物碱的最终生物合成步骤中发挥作用:两个A622基因(NITAB013664和NITAB026459)和四个BBLs (NITAB035568, NITAB035592, NITAB049634和NITAB072154)。多胺转运蛋白PUT1 (NITAB002823)也上调。最后，PMT-RNAi系和TN90对照的根样品中，细胞色素P450家族的几个基因(NITAB002110、NITAB053665、NITAB006704、NITAB012119、NITAB17325和NITAB055256)在打顶后出现上调。
根中基因表达比较发现，在PMT-RNAi抑制的株系中，顶盖和未顶盖植株中，NITAB041830和NITAB056529转录本分别对应NtMPO-S和NtMPO-T基因上调(见表2，图3)。NITAB041830和NITAB056529主要在根组织中表达(表2)。我们选择这些基因进行进一步分析，以确定它们对烟草叶片生物碱表型的抑制作用。
图3
NITAB041830 (MPO-S)和NITAB056529 (MPO-T)在烟草PMT-RNAi抑制系中表达的盒须图。数据单位为FPKM，由温室顶生植物根系的RNAseq分析得出。显著不同的值用字母表示，并分组为a、ab、bc或c(配对t检验，***p < 0.001)，异常值用圆圈表示
为了研究MPO基因在生物碱途径中的功能，并进一步研究阿那他滨的合成及其随后在叶片中的运输和积累，使用专门设计的插入物作为rnai构建物生成了MPO- rnai植物。几个品系生产和培养到第二代(T1株)，见图4。根据基因表达水平，选择3株MPO-T1株系(-3、-4和-15)进行后续分析。所选转化植株和对照植株在生理和生物量方面无显著变化。
图4
对照系和RNAi系MPO相对表达的盒须图。选择T1-3、T1-15和T1-4系，基于MPO基因NITAB041830 (MPO- s)和NITAB056529 (MPO- t)的极低表达，异常值以圆圈表示
我们测定了对照(WT)植株和3个MPO-RNAi抑制系成熟叶片(叶片)中烟碱和阿那他滨的含量。在所有MPO-RNAi品系中，尼古丁含量几乎完全下降，同时阿那他滨含量增加(约1.6倍)，见图5。在PMT和MPO抑制的植物中，对叶片中阿那他滨积累的定性影响是相当的。
图5
采用超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS，下图)测定的生物碱的盒须图，来自8个WT植物，3个独立的MPO-RNAi系，每个10个植物。显著不同的值用字母表示，并分组为a或b(配对t检验，***p < 0.001)，异常值以圆圈表示
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正如之前比较对照植株和转基因植株PMT活性抑制的研究[21,22,23]所报道的，我们还观察到生物碱含量从尼古丁(3077±260μg/g至134±16μg/g DW)转变为阿那他滨(169±39μg/g至1814±87μg/g DW)。有趣的是，在生物碱和转录组学分析之后，还没有使用这种转基因品系的顶级研究。事实上，2020年的一份报告首次分析了全球基因表达对顶部的反应。作者观察到所有已知的生物碱生物合成基因的上调，除了QPT。然而，在我们的实验中，QPT明显上调。目前的研究主要集中在生物碱和转录组水平上的早期诱导反应(处理后24小时)，以确定PMT抑制系和TN90对照系对打顶的早期反应因素。事实上，这样的处理可以诱导PMT抑制品系叶片中的阿那他滨积累[22]。我们观察到，打顶对促进根水平生物碱积累更有效。
基因表达的差异分析显示了表1中总结的两个主要趋势。首先，在不封顶处理和封顶处理的比较中，根系中显著差异表达基因的数量高于其他任何组合，从而反映了在代谢物水平上也观察到的早期反应。其次，PMT系与TN90对照的比较表明，表2中主要的显著差异是PMT基因，正如预期的那样。然而，同样有趣的是，浇头处理后也观察到类似的差异。事实上，表2中列出的大部分基因只有在打顶处理后才有显著差异表达。这表明，为了观察生物碱积累机制的差异，不应只研究在最佳条件下生长的烟草植物，而应研究受损植物。事实上，这当然是我们发现了以前的研究没有报道的转录本的原因[37]。AD和MPO基因对PMT转基因株系的打顶反应呈高表达。考虑到ADs，我们可以假设一个可能的解释，因为它们参与了吡啶环生物合成的早期阶段。mpo的情况更令人费解，因为这些酶直接参与吡咯烷环的形成。然而，由于MPO活性在吡啶途径的pmt后立即发生，结果可能表明它们的调节直接依赖于顶部处理和随后的激素反应，而不是n -甲基腐胺代谢物的可用性。
与对照相比，转基因系的SDS水平显著降低。这可能是由于对照植物的腐胺利用率较低。我们可以假设腐胺在PMT系中含量丰富，因为它不是PMT反应的底物，所以亚精胺向腐胺的SDS转化较少是必要的。亚精胺和精胺的适当平衡对于未受干扰的植物生长发育至关重要[38]，因此与转基因品系相比，SDS的活性要求相对较高。通过抑制PMT活性和/或顶部来扰乱多胺平衡，导致根中PUT1转运蛋白表达的变化。在水稻中发现的PUT1转运体是第一个具有特异转运亚精胺的多胺质体转运体，对植物的正常生长发育至关重要[39]。然而，同样的研究表明腐胺可以通过细胞膜运输。在我们的实验中，PUT1的上调可能与多胺浓度的增加有关，特别是因为在打顶处理后ODC的表达增加。
除了AD在吡啶环生物合成的早期阶段上调外，我们还测量了该过程所需的其他基因的表达。在转基因植株和对照植株中，AO、QS和QPT基因在打顶时均表达上调，且不受缺乏活性pmt的影响。这一观察结果支持了AO、QS和QPT基因对于吡啶环的形成所必需的假设，吡啶环是尼古丁和阿那他滨的主干。
有趣的是，负责最终生物碱生物合成的基因也上调了。先前观察到，抑制A622[14]和BBL[16,40]基因会导致阿那他滨生物合成终止，尽管其开始时水平非常低。在我们的分析中，观察到这两种氧化还原酶在PMT系对阿那他滨的生物合成中发挥了作用，这在观察A622和BBL基因在顶顶反应中的过度表达时得到了反映(见表2)。这些基因是必要的，但我们不能假设它们是最终尼古丁和阿那他滨生物合成的充分条件。考虑到这一差距，有趣的是，在我们的研究中，来自细胞色素P450家族的几个基因存在差异表达，包括来自CYP71D亚家族的两个基因。值得注意的是，在以前的研究中，来自这一特定进化支的基因被报道参与了生物碱的生物合成，尽管不是烟草本身。马达加斯加长春花(Catharanthus roseus)中特异性细胞色素p4500s(迄今发现的11个)的功能被证明对单萜吲哚生物碱(MIA)的生物合成至关重要，其中包括长春花碱和长春新碱[41]。在MIA生物合成中有被归类为CYP71D亚家族成员的基因，如tabersonine 16-羟化酶(CYP71D12和CYP71D351两个亚型)[42,43,44]和16-甲氧基tabersonine 3-加氧酶(CYP71D1)[45,46]。因此，我们可以推测，在我们的研究中属于同一CYP71D7亚家族的候选基因也可能参与生物碱的生物合成。证实这一假设需要进一步的转化和蛋白质活性研究。最后，另外三个候选基因在根茎中因打顶而上调，并被注释为拟南芥细胞色素CYP94C1的同源基因(见表2)。这些细胞色素P450基因被证明可以催化茉莉异异氨酸(JA-Ile)的氧化步骤，形成羧基衍生物12COOH-JA-Ile，反映了激素的催化转换[47]。
我们详细研究了mpo在阿那他滨生物合成中的作用。先前的研究表明，通过在烟草毛状根中构建rna沉默的MPO转基因系来抑制MPO，会阻碍尼古丁的合成，促进阿那他滨的积累[24]。目前还不清楚MPO受到抑制的完全生长的植物将如何发挥作用，以及哪些生物碱会在根和叶中积累。我们首次证明，具有组成性抑制mpo的植物几乎完全减少了尼古丁的合成，但也将这一过程转向了阿那他滨的生产。已有研究报道MATE和nup1型转运蛋白均对尼古丁具有亲和力，可作为有效的转运蛋白[26,27,28,29]。它们很可能在MPO抑制的细胞系中起作用并被表达，但需要更详细的以运输为重点的研究来证实它们对阿那他滨的亲和力。此外，关于阿那他滨生物合成的几个问题仍有待回答，特别是BBL基因的具体作用以及可能在该过程中必需的其他未知基因。未来的研究还应关注阿那他滨转运方式，它对阿那他滨在叶片中的积累有明显的影响。
PMT活性被抑制的转基因株系的基因表达分析表明，烟碱和去烟碱合成的最后步骤基本上是由相同的机制控制的。去甲尼古丁是尼古丁的一种去甲基化形式。在两种氧化还原酶的帮助下，参与吡啶环生物合成和最终生物碱生成的基因在PMT和TN90对照品种中都有类似程度的上调。除了PMT活性外，转基因植株与对照植株之间的差异还体现在SDS表达差异对多胺平衡的特定调节。有趣的是，所有打顶植株的MPO表达量都显著升高。此外，在转录组分析中发现了与缺乏活性PMT无关的两种天冬酰胺酶和细胞色素P450基因的顶部上调，这表明调控烟草生物碱含量的全新可能性。在我们研究的最后一部分，我们培育了MPO表达被抑制的转基因系。结果尼古丁的积累几乎完全停止，而阿那他滨的含量增加了约1.6倍。这是第一个具体的证据，证明抑制MPO会改变生物碱池，有利于阿那他滨，并且这种阿那他滨可以有效地从根转运到烟叶。这种转运先前被提出并测试了特定转运体如MATE和NUP1[26,27,28,29]。这里最有可能的情况是，TN90白肋烟作为转化系的亲本植物，但我们不能说这对其他烟草品种或物种是可复制的。许多烟草属植物在根中积累了大量的生物碱，但这并不能转化为有效的转运到叶片中[30]。对特定转运基因进行测序、抑制/敲除或进一步表达的进一步研究，将为了解阿那他滨在烟草中的转运提供坚实的基础。这也有利于在未来的研究中测量其他化合物，以揭示更完整的生物合成图景，如生物碱生物合成中的多胺、氨基酸和其他中间体。
采用内部采集的烟叶N. TN90品种种子。TN90种子也可以在美国烟草种质资源收集(指定为PI 543792, Nicotiana tabacum L.， 'TN 90')上公开获取，可供专业植物育种家和其他职业研究科学家免费使用和购买(https://www.ars-grin.gov/collections)。转基因TN90株系PMT1 (06TN2046)、PMT2 (06TN2048)和PMT3 (06TN2052)来自美国奥驰亚客户服务有限公司(Richmond, VA, USA)。如专利WO2015157359A1[48]所述，在35S作为本构启动子的控制下，利用农杆菌介导的转化产生PMT系。发芽前，用蒸汽氯气法对种子进行灭菌;将50ml 5%终氯与种子玻璃管一起置于钟形罩中。然后，在溶液中加入3ml(37%)的盐酸，孵育种子2小时。在层流罩下，将种子置于植物生长室内(24°C，光照16 h / 20°C，黑暗8 h)的生长培养基上，培养4周。将发育良好的植株移入温室，在人工光周期(光照16 h /暗8 h)下，在5-L盆栽中分10个重复培养，直至植株完全长成。在开花时，一半的TN90和PMT植物被顶。在打顶后24 h，收集具有代表性的、成熟的叶片和具有代表性的横径根进行分析。所有样品立即冷冻在液氮中，保存用于代谢物和转录组学分析。
收集的样品在装有玻璃珠的容器中以400 rpm的转速进行冻干和振荡(叶片8 h，根24 h)。在这一点上，仍然未被破坏的根在砂浆中研磨到尽可能小的水平。生物碱分析样品(根据卡明斯基等人[30]的方法)采用超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC-MS)制备:用水/甲醇(3:7,5 mL)在旋转摇床上搅拌24小时，提取约25 mg细粉，过滤(fishbrand?无菌PES注射器过滤器，孔径为0.2μm;Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)，用提取混合物1:50稀释。在Vanquish Duo UHPLC系统和Orbitrap IDX质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上同时测定所有六种生物碱。色谱柱为Acquity HSS T3 (1.7 μm, 100 × 2.1 mm;沃特斯，米尔福德，马萨诸塞州，美国);柱温设为45℃。洗脱液为乙酸铵水溶液(10 mM, pH=8.9);洗脱液A)和乙酸铵水溶液(10mm;洗脱液B)作为梯度(0 min-10% B;0.25 min-10% B;4.25 min-98% B;5.25 min-98% B;流量:0.5 mL/min)。注射量为5 μL。烟碱、阿那他碱、肌胺、去甲烟碱、可替宁和阿那他碱分别在3.89、3.27、3.47、2.76、2.62和3.36 min后洗脱，电喷雾正离子后检测为[M + H]+伪分子离子。
用液氮将烟草样品在砂浆中研磨成细粉，取200 mg样品进行RNA提取。RNA提取用RNeasy?Plant Mini Kit(?QIAGEN n.v.， Venlo, Netherlands)进行，随后用TruSeq?搁浅总RNA金(?Illumina, Inc.， San Diego, CA, USA)制备测序文库(无片段化)。文库随后使用Illumina HiSeq?4000系统进行测序。使用HiSeq?3000/4000 PE Cluster Kits和HiSeq?3000/4000 SBS Kits(?Illumina, Inc)进行配对端2 × 150bp测序。
生成的测序数据由Illumina baseSpace?Clarity LIMS(?Illumina, Inc.)进行解复用，随后导入Qiagen CLC Genomics Workbench 11.0.1版(Qiagen公司旗下CLC bio)。使用“RNA-Seq Analysis”2.16工具将转录组reads定位到更新版本的烟草烟草参考基因组[49]，相似度为0.95 (S=0.95)，片段长度为0.95 (L=0.95)作为定位标准。不匹配、插入和删除成本分别设置为2、3和3。不执行全局对齐，自动检测成对距离。最大读取命中数设置为10，配对读取计数为2。检索参考基因组中每个基因的RPKM值，包括那些没有转录模型的基因。没有创建融合基因表。使用CLC的“PCA For RNA-Seq”工具对每个样本进行主成分分析(PCA)。使用“DGE实证分析”工具进行基因表达分析，其中通过DGE实证分析检索每个基因的RPKM值并进行比较，DGE采用了Robinson和Smyth[50]开发的“精确测试”，该测试被纳入EdgeR Bioconductor软件包[51]。两两比较p值≤0.05，绝对倍数变化≥2的基因为差异显著。
选择抑制MPO两个拷贝(MPO- s和MPO- t)表达的特异性DNA片段(GATCCAAATGATCCACATTATAGGAAGAATGCATTTGATGCAGGAGAAGATGGCCTTGGAAAGAATGCTCATT)克隆于农杆菌芽碱合成酶基因的3′NOS终止序列之间[52]。采用标准农杆菌介导转化方案对白肋烟品种TN90进行了转化[53]。从三个独立的T0系中收获的种子表现出最强的MPO沉默。将10个品系中的T1株在温室中培养，通过聚合酶链反应(PCR)选择基因组DNA中存在插入物的植株，引物为MMV-F (gacgtctaatcccaacttcgtc)和IPMS2-R (gacgtctaatcccaacttcgtc)(5′-3′)。为了验证后代表现出有效的转录抑制，我们从每个独立转化事件的转基因植株及其对应的对照植株中分离RNA，利用以下引物(5′~ 3′)MPO- f1 (gattattgatgacttggatcttgtgatg)、MPO- r1 (TATATTCCTTCAACTGGTCTTGCATA)进行定量PCR实验，评估MPO基因的表达水平。
序列。
表1。绘制参考基因组统计数据，包括读取数以及基因组和基因的绘制读取百分比[%]。
表2。至少在其中一个比较中存在2075个具有统计学差异表达的基因。
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